میکروسکوپ یکی از اساسی ترین و حیاتی ترین ابزارهای تخصصی در محیط های آزمایشگاهی به شمار می رود که نقش بنیادین در علوم زیستی، گیاه شناسی، دامپزشکی، پزشکی تشخیصی، زمین شناسی و حتی متالورژی و مهندسی مواد دارد. این تجهیزات کارآمد با فراهم سازی بستر بزرگنمایی و تفکیک ساختارهای میکرومتری و نانومتری، امکان بررسی دقیق ذراتی را به پژوهشگران می دهند که دیدن آنها با چشم غیرمسلح ناممکن است.
تاریخچه تکامل این ابزار از وسایل ساده تفریحی در قرن هجدهم تا میکروسکوپ های مدرن نوری و سیستم های فوق پیشرفته الکترونی و پراب پویشی امروزی، تحولی بنیادین در درک جهان بیولوژی و ذرات ایجاد کرده و مرزهای اکتشافات علمی و صنعتی بشر را به شکلی بی سابقه ارتقا داده است.
سیر تحول میکروسکوپ نشان دهنده پیوند عمیق علم اپتیک با نیازهای تشخیصی بشر است. اولین نمونه های میکروسکوپ مرکب در حوالی سال ۱۶۰۰ میلادی توسط هانس و زاکاریاس جنسن در هلند ساخته شد. در طول قرن هجدهم میلادی، میکروسکوپ ها بیشتر جنبه سرگرمی و وسایل تفریحی داشتند و تصاویر حاصل از آنها به دلیل خطاهای نوری متعدد، وضوح پایینی داشت.
با پیشرفت فنون تراش و پولیش عدسی ها، خطاهای کروی و رنگی که به کجنمایی معروف بودند مهار شدند و عدسی های شیئی توانستند جزئیات واقعی نمونه ها را منعکس نمایند. نقطه عطف محاسبات علمی در سال ۱۸۷۳ میلادی توسط فیزیکدان برجسته ارنست آبه رقم خورد که توانست فرمولاسیون ریاضی و محدوده بزرگنمایی مفید میکروسکوپ نوری را تعریف کند و نشان دهد که بزرگنمایی موثر نوری بین ۵۰ تا ۲۰۰۰ برابر است و وابستگی مستقیمی به طول موج نور دارد.
مکانیزم تشکیل تصویر در میکروسکوپ های مرکب بر پایه عبور فوتون های نور و شکست امواج در عدسی های محدب همگرا طراحی شده است. فوتون ها با سرعت بسیار بالا و به صورت جبهه های پیوسته حرکت می کنند و هنگام برخورد با نمونه، تحت تاثیر کنتراست نوری و تفاوت ضریب شکست اجزا قرار می گیرند. عدسی شیئی که دارای فاصله کانونی کوتاهی است، تصویری حقیقی، وارونه و بزرگ شده از جسم مورد آزمایش در داخل لوله میکروسکوپ تشکیل می دهد.
در مرحله بعد، عدسی چشمی مانند یک ذره بین پیشرفته وارد عمل شده و تصویر حاصل از عدسی شیئی را دوباره دریافت کرده و یک تصویر نهایی مجازی، مستقیم نسبت به تصویر اول و به شدت بزرگ شده به چشم ناظر منتقل می نماید تا بیشترین جزئیات ممکن با وضوح بالا قابل بررسی باشد.
یکی از مهم ترین مفاهیم در بررسی میکروسکوپ ها، تفاوت اساسی میان بزرگنمایی صرف و قدرت تفکیک یا رزولوشن است. قدرت تفکیک چشم انسان حدود ۰.۱ میلی متر است، در حالی که در میکروسکوپ های نوری استاندارد این مقدار به ۲۴ صدم میکرون می رسد. بر اساس قوانین فیزیک امواج، توانایی تفکیک دو نقطه بسیار نزدیک به هم با طول موج نور به کار رفته نسبت مستقیم دارد؛ هر اندازه طول موج کوتاه تر باشد، وضوح و قدرت جداسازی سیستم افزایش می یابد.
بنابراین ساخت دستگاه هایی با بزرگنمایی های بالاتر از حد معین بدون توجه به طول موج، تنها تصویری تار و بی کیفیت ایجاد می کند که به آن بزرگنمایی غیرمفید یا تهی می گویند و برای مشاهده فواصل کمتر از ۲۵۰۰ آنگستروم، عبور از محدودیت پراش نور الزامی خواهد بود.
میکروسکوپ های نوری مدرن آزمایشگاهی از منابع نوری داخلی تعبیه شده در بدنه استفاده می کنند و به دلیل قابلیت نمایش تصاویر رنگی و طبیعی، بی نظیر هستند. این میکروسکوپ ها بر حسب نوع قرارگیری اج تفاوت ضریب شکست اجزا قرار می گیرند. عدسی شیئی که دارای فاصله کانونی کوتاهی است، تصویری حقیقی، وارونه و بزرگ شده از جسم مورد آزمایش در داخل لوله میکروسکوپ تشکیل می دهد.
در مرحله بعد، عدسی چشمی مانند یک ذره بین پیشرفته وارد عمل شده و تصویر حاصل از عدسی شیئی را دوباره دریافت کرده و یک تصویر نهایی مجازی، مستقیم نسبت به تصویر اول و به شدت بزرگ شده به چشم ناظر منتقل می نماید تا بیشترین جزئیات ممکن با وضوح بالا قابل بررسی باشد.
یکی از مهم ترین مفاهیم در بررسی میکروسکوپ ها، تفاوت اساسی میان بزرگنمایی صرف و قدرت تفکیک یا رزولوشن است. قدرت تفکیک چشم انسان حدود ۰.۱ میلی متر است، در حالی که در میکروسکوپ های نوری استاندارد این مقدار به ۲۴ صدم میکرون می رسد. بر اساس قوانین فیزیک امواج، توانایی تفکیک دو نقطه بسیار نزدیک به هم با طول موج نور به کار رفته نسبت مستقیم دارد؛ هر اندازه طول موج کوتاه تر باشد، وضوح و قدرت جداسازی سیستم افزایش می یابد.
بنابراین ساخت دستگاه هایی با بزرگنمایی های بالاتر از حد معین بدون توجه به طول موج، تنها تصویری تار و بی کیفیت ایجاد می کند که به آن بزرگنمایی غیرمفید یا تهی می گویند و برای مشاهده فواصل کمتر از ۲۵۰۰ آنگستروم، عبور از محدودیت پراش نور الزامی خواهد بود.
میکروسکوپ های نوری مدرن آزمایشگاهی از منابع نوری داخلی تعبیه شده در بدنه استفاده می کنند و به دلیل قابلیت نمایش تصاویر رنگی و طبیعی، بی نظیر هستند. این میکروسکوپ ها بر حسب نوع قرارگیری اجزا و سیستم نوری به مدل های ایستاده، معکوس اینورت، زمینه تاریک، فاز کنتراست و پلاریزان دسته بندی می گردند. مدل های فاز کنتراست و زمینه تاریک امکان تفکیک بخش های درون سلولی شفاف مانند میتوکندری ها را بدون نیاز به رنگ آمیزی های مخرب فراهم می سازند.
از میکراویری از ساختارهای درونی ایجاد می کنند؛ در حالی که مدل های روبشی با اسکن سطح نمونه، تصاویری سه بعدی و عمیق از توپوگرافی ذرات ارائه می دهند. صفحه دریافت کننده تصویر با فسفید روی پوشانده شده که در اثر برخورد الکترون ها می درخشد و توسط دوربین های دیجیتال عکاسی می شود. این ابزارها در ویروس شناسی، نانوتکنولوژی، کریستالوگرافی، آنالیز ذرات و سرما زیست شناسی کارایی منحصر به فرد دارند.
| نوع میکروسکوپ | منبع تابش / روش کار | حداکثر بزرگنمایی تقریبی | کاربردهای اصلی و ویژگی ها |
| میکروسکوپ نوری مرکب (Brightfield) | نور مرئی (لامپ هالوژن یا ال ای دی) | تا ۱,۵۰۰ تا ۲,۰۰۰ برابر | بررسی مقاطع بافتی، باکتری ها، سلول های خونی و آموزشی در آزمایشگاه های تشخیص طبی و زیست شناسی |
| میکروسکوپ استریو / لوپ (Stereomicroscope) | نور بازتابی یا عبوری مرئی | ۱۰ تا ۱۰۰ برابر | مشاهده نمونه های سه بعدی حجیم، کالبدشکافی، تشریح بافت های گیاهی، حشره شناسی و متالورژی |
| میکروسکوپ فاز کنتراست (Phase Contrast) | نور مرئی با فیلترهای حلقوی برای تغییر فاز نور | تا ۱,۵۰۰ برابر | مشاهده سلول های زنده، مژه داران، میتوکندری و اندامک های شفاف بدون نیاز به رنگ آمیزی های مخرب |
| میکروسکوپ زمینه تاریک (Darkfield) | نور مرئی با مسدودکننده مخروط مرکزی پرتوها | تا ۱,۰۰۰ برابر | شناسایی باکتری های بسیار باریک (مانند اسپیروکت ها و ترپونما پالیدوم) و نمونه های با کنتراست بسیار ضعیف |
| میکروسکوپ فلورسانس (Fluorescence) | نور فرابنفش (UV) یا لیزر تحریکی | تا ۱,۵۰۰ برابر | ایمونولوژی، ژنتیک (روش فیش)، بررسی نشانگرهای زیستی، هیبریداسیون دی ان ای و پیگیری داروها |
| میکروسکوپ معکوس یا اینورت (Inverted) | نور مرئی (عدسی شیئی زیر نمونه قرار دارد) | تا ۱,۰۰۰ برابر | بررسی فلاسک های کشت بافت، محیط های کشت سلولی زنده، جنین شناسی و میکرواینجکشن |
| میکروسکوپ پلاریزان (Polarizing) | نور قطبیده (با عبور از پولارایزر و آنالایزر) | تا ۱,۰۰۰ برابر | پتروگرافی، زمین شناسی، کانی شناسی، بلور شناسی، شناسایی آزبست و متالورژی ساختاری |
| میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM) | باریکه الکترونی عبوری از نمونه فوق نازک | تا بیش از ۲,۰۰۰,۰۰۰ برابر | مطالعه ساختار درون سلولی، ویروس شناسی، نانوتکنولوژی، پروتئین ها و کریستالوگرافی در ابعاد زیر نانومتر |
| میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) | باریکه الکترونی روبش کننده سطح نمونه | تا ۱,۰۰۰,۰۰۰ برابر | تصویربرداری سه بعدی از سطح نمونه ها، آنالیز توپوگرافی، نانوذرات، شکست سنجی مواد و متالورژی |
| میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) | پراب مکانیکی بسیار ظریف (کانتی لیور) | در ابعاد نانومتر و آنگستروم |
نقشه برداری توپوگرافی سطح مواد در مقیاس اتمی، مطالعه خواص مکانیکی پلیمرها و بررسی برهم کنش های مولکولی |
آماده سازی نمونه ها جهت قرارگیری در محفظه خلاء میکروسکوپ های الکترونی فرایندی بسیار پیچیده، حساس و زمان بر است. بافت ها و ارگانیسم های بیولوژیکی قبل از تصویربرداری باید مراحل دقیق تثبیت شیمیایی، روش های فریز سریع یا کریوفیکسیشن و رطوبت زدایی کامل را طی کنند تا ساختار سلولی تحت خلاء دچار فروپاشی نگردد.
پس از آن، نمونه ها در رزین های اپوکسی قالب گیری شده و به کمک دستگاه های اولترامیکروتوم به مقاطعی با ضخامت کمتر از چند نانومتر برش می خورند. در نهایت با استفاده از نمک های فلزات سنگین مانند اورانیل استات و سیترات سرب رنگ آمیزی می شوند یا در مدل های روبشی با لایه ای بسیار نازک از طلا پوشش دهی می گردند تا بازتاب الکترونی بدون تجمع بار ساکن شکل گیرد.
در صنایع معدنی، ژئولوژی و متالورژی نیاز به تجهیزات تخصصی تری نسبت به محیط های پزشکی وجود دارد. میکروسکوپ پلاریزان با استفاده از دو فیلتر پولارایزر و آنالایزر، نور قطبیده تولید کرده و برای مطالعه رفتار نوری بلورها، سنگ های رسوبی، دگرگونی و پترولوژی سنگ های آذرین به کار می رود. میکروسکوپ های پیناکولار دوچشمی نیز برای مطالعات فسیل شناسی کاربرد وسیعی دارند.
میکروسکوپ های انعکاسی با تابش نور از بالا برای شناسایی کانی های فلزی کدر که نور را عبور نمی دهند به کار می روند. فراتر از این موارد، نسل میکروسکوپ های پراب پویشی نظیر میکروسکوپ نیروی اتمی، میکروسکوپ تونلی روبشی، نیروی مغناطیسی و ولتاژ پویشی با لمس فیزیکی سطح نمونه در ابعاد آنگستروم، نقشه برداری اتمی را میسر می سازند.
ساختار مکانیکی میکروسکوپ نقش مهمی در پایداری و راحتی کاربر حین ساعت ها کار تحقیقاتی ایفا می کند. پایه دستگاه که معمولا به فرم نعل اسبی یا یو شکل طراحی می شود، دارای وزن بالایی است تا تعادل میکروسکوپ حفظ شده و از لرزش های محیطی جلوگیری شود. لوله میکروسکوپ ممکن است به صورت تک چشمی مونوکولار یا دو چشمی باینوکولار باشد که مدل های دو چشمی مانع خستگی زودرس عضلات چشم می گردند. عدسی های چشمی وظیفه اندازه گیری، بزرگنمایی ثانویه و رفع خیرگی با دیافراگم را دارند و در دو نوع معروف هویگنس (منفی با قیمت اقتصادی تر) و رامزدن (مثبت با میدان دید بازتر و تصحیح اپوکروماتیک) روی دستگاه ها نصب می گردند.
عدسی های شیئی قلب تپنده و تعیین کننده ترین بخش کیفیت تصویر در میکروسکوپ های نوری به شمار می روند که بر روی یک کلاهک چرخان چهار یا پنج تایی سوار می شوند. این عدسی ها شامل انواع آکروماتیک ۱۰ برابر با گشودگی عددی ۰.۳، آکروماتیک ۴۰ برابر با گشودگی ۰.۶۵، فلورئیت ۴۵ برابر و آکروماتیک ۹۰ تا ۱۰۰ برابر با گشودگی عددی ۱.۲ هستند.
عدسی های با بزرگنمایی کم به صورت خشک عمل می کنند، اما عدسی های با توان بالا نیازمند تکنیک ایمرسیون با روغن سدر یا پارافین مایع هستند. قرار دادن قطره روغن با ضریب شکستی برابر با شیشه میان عدسی و لامل، مانع از شکست و انحراف نور شده، گشودگی عددی را بالا می برد و وضوح و شفافیت تصویر را به اوج می رساند.
روشنایی محیط هرگز نمی تواند نور یکنواخت و متمرکزی را برای تصویربرداری آزمایشگاهی فراهم سازد، بنابراین استفاده از سیستم های روشنایی مصنوعی الزامی است. لامپ های تنگستن در مدل های آموزشی، لامپ های هالوژن با نور سفید عالی برای فوتومیکروگرافی، و لامپ های تخلیه الکتریکی جیوه ای و زنون به دلیل تولید تابش های فرابنفش در تکنیک های فلورسانس استفاده می شوند.
در زیر استیج یا محل استقرار نمونه، کندانسور قرار دارد که وظیفه آن متمرکز ساختن دقیق مخروط نوری بر روی لام است. انواع کندانسورها شامل مدل ساده آبه، کندانسورهای آکرومات و آپلانات برای کارهای فوق ریز تشخیصی، و مدل های با عدسی متحرک برای تطبیق توان های مختلف بزرگنمایی هستند.
میکروسکوپ ها به عنوان یکی از ستون های اصلی دانش و تشخیص آزمایشگاهی، دنیایی از ناشناخته های میکروسکوپی را در برابر چشمان محققان قرار داده اند. تفکیک هوشمندانه میان میکروسکوپ های نوری با نمایش طبیعی رنگ ها و سیستم های الکترونی با بزرگنمایی های میلیونی، انتخابی بر مبنای نیاز پژوهشی است. حفظ دقت، کالیبراسیون منظم سیستم های اپتیکی، پایداری الکترونیکی و تامین قطعات یدکی استاندارد ضامن عملکرد بی نقص این تجهیزات در آزمایشگاه های سراسر کشور خواهد بود.
پژوهشگران، مراکز درمانی و آزمایشگاه های صنعتی می توانند برای مشاوره، خرید تجهیزات و بهره مندی از خدمات فنی تخصصی از پشتیبانی کیان پرتو کمک گرفته و تجهیزات تحقیقاتی خود را با بالاترین استانداردهای روز دنیا تامین نمایند.
تفاوت بنیادین این دو گروه در نوع منبع تابش و میزان بزرگنمایی و قدرت تفکیک آنها است. میکروسکوپ نوری از فوتون های نور مرئی و عدسی های شیشه ای استفاده می کند و امکان مشاهده نمونه های زنده و بافت های رنگی را تا بزرگنمایی حدود ۱۵۰۰ برابر فراهم می سازد؛ در حالی که میکروسکوپ الکترونی با استفاده از پرتوهای الکترونی متمرکز و عدسی های مغناطیسی در محیط خلاء، می تواند بزرگنمایی های فوق العاده ای تا بیش از ۱ میلیون برابر ایجاد کند و ساختارهای فوق ریز مانند ویروس ها و اندامک های درونی سلول را با وضوح نانومتری نمایش دهد.
هنگام استفاده از عدسی های شیئی قوی (مانند عدسی های ۱۰۰ برابر)، فاصله میان عدسی و لامل بسیار کم می شود و شکست نور در لایه هوای میان آنها سبب کاهش کیفیت و وضوح تصویر می گردد. قرار دادن یک قطره روغن ایمرسیون (مانند روغن سدر) به دلیل داشتن ضریب شکستی برابر با شیشه، مانع از انحراف و پراکندگی پرتوهای نور می شود، گشودگی عددی یا ان ای عدسی را افزایش می دهد و تصویری بسیار شفاف تر با قدرت تفکیک بالاتر ایجاد می کند.
بزرگنمایی مفید در میکروسکوپ های نوری توسط پدیده ای فیزیکی به نام محدودیت پراش نور و طول موج نور مرئی محدود می شود. بر اساس قوانین اپتیک و محاسبات ارنست آبه، حداکثر تفکیک نوری حدود ۲۴ صدم میکرون و حداکثر بزرگنمایی موثر حدود ۲۰۰۰ برابر است. افزایش بزرگنمایی فراتر از این حد تنها باعث بزرگ تر شدن یک تصویر تار بدون نمایش جزئیات تازه می گردد که به آن بزرگنمایی تهی یا غیرمفید می گویند.
آخرین مقالات
